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盖塔病毒(GETV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)图片
产品货号:
BTN14-46800
中文名称:
盖塔病毒(GETV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)
英文名称:
Getah virus RT-qPCR Kit(SYBR)
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品是基于染料法qRT-PCR原理开发的盖塔病毒(GETV)检测试剂盒。


盖塔病毒(Getah virus,GETV)是一种RNA病毒,属于披膜病毒科甲病毒属的虫媒病毒。GETV感染已在多种脊椎动物中发现,包括人类、猴子、鸟类、猪、马和其他哺乳动物。GETV感染可导致马出现发热、全身皮疹和腿水肿,仔猪关节炎和母猪生殖障碍等。目前GETV在世界范围内流行较为广泛,近年来逐步在猪群中暴发,导致部分猪场经济损失严重。因此灵敏快捷诊断GETV具有重要的意义。


  1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,只需要提供RNA样品。
  2. 灵敏度比常规RT-PCR高10~100倍,可以达到至少100拷贝/反应。
  3. 根据盖塔病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性,不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
  4. 使用一管式qRT-PCR技术,RT和PCR两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
  5. 本制品既可用于定性检测,也可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少有5个数量级。
  6. 本制品足够50次20μL体系的RT-PCR反应
  7. 只能用于科研,不能用于临床。



组分规格
2×SYBR qRT-PCR缓冲液500μL
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2.050μL
荧光PCR专用模板稀释液1mL
盖塔病毒qRT-PCR引物干粉50次
盖塔病毒qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)50μL

保存:-20℃,有效期一年,阳性对照需要单独放置。


引物-探针干粉在使用前需要短暂离心,然后在离心管中加入140μL的超纯水充分混匀后再使用,未用完的需要-20℃保存。


一、稀释阳性对照
以101~106这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。
  1. 标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2,1。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
  2. 换枪头,在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  3. 换枪头,在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  4. 换枪头,在4号管中加入5μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×104拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  5. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。


二、样品RNA的制备
  1. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上得到的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×104拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的样本起始体积一样)。可以用水作为制备的阴性对照。
  2. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容,也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。


三、设置RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
  1. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
  2. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):
    成分样品管
    N+2个
    RT-PCR
    阴性对照
    RT-PCR阳性对照
    (1~6管)
    2×SYBR qRT-PCR缓冲液10μL10μL各10μL
    盖塔病毒qRT-PCR引物混合液2.5μL2.5μL各2.5μL
    N+2个RNA模板6.5μL--
    自备超纯水-6.5μL-
    6个阳性对照稀释液--各6.5μL
    10×SYBR qRT-PCR酶混合液1μL1μL1μL
  3. 上机后按下面参数进行RT-PCR。
    过程温度时间
    RT(逆转录)50℃30分钟
    预变性95℃2分钟
    PCR反应
    (35个循环)
    95℃20秒
    56℃60秒(采集SYBR通道的荧光信号)
    按仪器预设程序进行溶解曲线分析


四、数据处理
  1. 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值,但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品(包括对照和待测样品),归为假阳性,数据无效,不予以分析。
    Tm跟阳性对照Tm一致的,为有效Ct。
  2. 如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样,说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染,则此次实验无效,需要解决污染问题再进行实验。
  3. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照)是假阳性,可以继续分析其它样品有效数据。
  4. 对定量检测,以阳性对照样品的浓度的log值为横轴,以有效Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再换算出待测样品的RNA浓度。
  5. 对定性检测,则有有效Ct值的为阳性,无有效Ct值的为阴性。




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