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本制品是基于染料法qRT-PCR原理开发的盖塔病毒(GETV)检测试剂盒。


盖塔病毒(Getah virus,GETV)是一种RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属的虫媒病毒。GETV感染已在多种脊椎动物中发现，包括人类、猴子、鸟类、猪、马和其他哺乳动物。GETV感染可导致马出现发热、全身皮疹和腿水肿，仔猪关节炎和母猪生殖障碍等。目前GETV在世界范围内流行较为广泛，近年来逐步在猪群中暴发，导致部分猪场经济损失严重。因此灵敏快捷诊断GETV具有重要的意义。

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。
   
2. 灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到至少100拷贝/反应。
   
3. 根据盖塔病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
   
4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
   
5. 本制品既可用于定性检测，也可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少有5个数量级。
   
6. 本制品足够50次20μL体系的RT-PCR反应
7. 只能用于科研，不能用于临床。

组分	规格
2×SYBR qRT-PCR缓冲液	500μL
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2.0	50μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
盖塔病毒qRT-PCR引物干粉	50次
盖塔病毒qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	50μL

保存：-20℃，有效期一年，阳性对照需要单独放置。


引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入140μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。


一、稀释阳性对照
以10¹～10⁶这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。

1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
2. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
3. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
5. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

6. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上得到的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的样本起始体积一样)。可以用水作为制备的阴性对照。
   
7. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

8. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
9. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
   

   成分	样品管 N+2个	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR阳性对照 (1～6管)
   2×SYBR qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
   盖塔病毒qRT-PCR引物混合液	2.5μL	2.5μL	各2.5μL
   N+2个RNA模板	6.5μL	-	-
   自备超纯水	-	6.5μL	-
   6个阳性对照稀释液	-	-	各6.5μL
   10×SYBR qRT-PCR酶混合液	1μL	1μL	1μL

10. 上机后按下面参数进行RT-PCR。
    

    过程	温度	时间
    RT(逆转录)	50℃	30分钟
    预变性	95℃	2分钟
    PCR反应 (35个循环)	95℃	20秒
    	56℃	60秒(采集SYBR通道的荧光信号)
    按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

11. 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品(包括对照和待测样品)，归为假阳性，数据无效，不予以分析。
    Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
    
12. 如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
    
13. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照)是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
    
14. 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
    
15. 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。

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